Este estudio evaluó la diversidad genética y la estructura poblacional del cocodrilo americano (Crocodylus acutus) en el límite sur de su distribución, en la cuenca binacional del río Puyango (Ecuador–Perú). El objetivo fue caracterizar genéticamente estas poblaciones australes, críticamente amenazadas y hasta ahora inexploradas, con el fin de aportar información científica que oriente estrategias de conservación. Se analizaron 18 individuos de tres localidades: Reserva Natural Cazaderos, Parque Histórico de Samborondón y Centro de Acuicultura Tuna Carranza, mediante marcadores mitocondriales (D-loop) y microsatélites nucleares. Las secuencias se obtuvieron por tecnología Oxford Nanopore y fueron depuradas con herramientas bioinformáticas; los análisis poblacionales se realizaron con DnaSP, Arlequin y STRUCTURE. Los resultados revelaron homogeneidad absoluta en el ADN mitocondrial, con un único haplotipo (Hap24) presente en todas las muestras, no registrado en otras poblaciones de la especie y que refleja diversidad haplotípica y nucleotídica de cero. En contraste, los microsatélites mostraron una estructura genética moderada a alta entre localidades, con valores de FST significativos que evidenciaron fuerte diferenciación entre Loja y Tumbes. Los análisis bayesianos identificaron dos agrupamientos genéticos principales, corroborando la diferenciación intraregional. Se concluye que las poblaciones de C. acutus del sur de Ecuador y norte de Perú constituyen un linaje materno único y aislado, con diversidad extremadamente baja que sugiere un efecto fundador histórico y desconexión prolongada de otras poblaciones continentales. Esta singularidad genética, sumada a su vulnerabilidad, respalda su reconocimiento como una Unidad de Conservación distintiva. Se recomienda priorizar la protección de su hábitat, mantener la conectividad entre subpoblaciones locales y evitar la translocación de individuos desde otras regiones que comprometa su integridad genética. Este trabajo constituye la primera evidencia genética para la conservación de C. acutus en esta región crítica.

Palabras clave: Crocodylus acutus, Diversidad genética, Estructura poblacional, Conservación, Cuenca del Puyango, Marcadores moleculares, Genética de la conservación.