Ilex guayusa Loes. (Aquifoliaceae) es una planta ancestral amazónica de Ecuador empleada tradicionalmente en infusiones con efectos estimulantes, antioxidantes, antiinflamatorios y digestivos. Este estudio tuvo como objetivo evaluar la influencia de la edad foliar (hojas jóvenes y adultas) en tres chacras de Napo (Alto Talag, Alto Pano y Alto Tena) sobre el perfil metabolómico y la actividad antimicrobiana de extractos hidroetanólicos. Las hojas se clasificaron por edad, se secaron a 35 °C, molieron y maceraron (100 g en 500 mL de etanol al 70% por 72 h). Posteriormente, los extractos fueron filtrados, concentrados en rotoevaporador y liofilizados. El análisis metabolómico por UPLC-MS/MS identificó cuatro compuestos predominantes: ácido oleanólico 3-O-glucurónido, ácido quínico, ácido neoclorogénico y ácido cafeico, metabolitos descritos previamente como responsables de efectos biológicos por su capacidad de alterar membranas bacterianas o inducir especies reactivas de oxígeno. La actividad antimicrobiana se evaluó mediante el método de difusión en disco (Kirby-Bauer) frente a Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis, empleando concentraciones de 50, 25 y 12.5 mg/mL. Los resultados evidenciaron variaciones según la chacra y la edad de las hojas: los extractos de hojas adultas mostraron halos de inhibición de hasta 18 mm frente a S. aureus (12.5 mg/mL), mientras que los de hojas jóvenes resultaron más efectivos contra S. epidermidis (16 mm a 12.5 mg/mL). En conclusión, tanto la ubicación geográfica como la ontogenia foliar influyen en la síntesis de metabolitos secundarios y en la respuesta antimicrobiana de I. guayusa. Estos hallazgos destacan la importancia de considerar el sitio de recolección y la edad foliar para optimizar el aprovechamiento terapéutico de esta especie frente a bacterias grampositivas.