La inocuidad de los alimentos es un pilar fundamental para garantizar la salud pública, especialmente en sistemas agropecuarios donde la producción primaria está estrechamente vinculada al consumo humano. En la provincia del Guayas, Ecuador, se realizó un estudio microbiológico en vacas lecheras del cantón Daule, zona de alta actividad agropecuaria con sistemas de ganadería extensiva y ordeño manual. El objetivo fue detectar mastitis subclínica mediante el California Mastitis Test (CMT) y caracterizar la resistencia antimicrobiana de Staphylococcus spp. aislados de leche bovina. Se recolectaron 75 muestras bajo principios bioéticos y se procesaron siguiendo protocolos microbiológicos estandarizados: preenriquecimiento en Caldo Tripticasa de Soya con NaCl y piruvato de sodio, siembra en agar sangre, tinción de Gram, prueba de catalasa y antibiograma por difusión en disco (Kirby-Bauer), utilizando antibióticos veterinarios (Gentamicina, Tetraciclina, Penicilina, Cefalexina y Amoxicilina + Ácido clavulánico). Los halos de inhibición se interpretaron según los puntos de corte del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). El análisis estadístico reveló diferencias significativas en los perfiles de sensibilidad (χ² = 645.24; p < 0.001), mientras que el índice de resistencia múltiple (MAR) mostró valores críticos (≥0.6) en todos los antibióticos evaluados, destacando Penicilina (0.679) y Tetraciclina (0.667), lo que refleja una presión antimicrobiana sostenida. El análisis de conglomerados jerárquicos permitió identificar agrupamientos terapéuticos y redundancias funcionales, mostrando la cercanía entre β-lactámicos y la separación de Gentamicina y Tetraciclina por sus mecanismos de acción. Los resultados indican la posible circulación de genes de resistencia como blaZ, mecA, tetM, tetO, con implicaciones zoonóticas relevantes. El estudio resalta la necesidad de fortalecer la vigilancia microbiológica local, racionalizar el uso de antimicrobianos con criterios farmacodinámicos y adoptar el enfoque One Health para contener la diseminación de resistencia, preservar la eficacia terapéutica y proteger la salud pública en entornos clínicos y agropecuarios.